western blot中脫脂奶粉的作用

封閉

原理：用非抗原的蛋白去封閉膜的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，避免標(biāo)記抗體固定在膜上引起背景增高，常用的封閉液有BSA,脫脂奶粉,明膠, tween-20等,一般脫脂奶粉。

實(shí)驗(yàn)步驟：

5%脫脂奶粉（用1x TBS配制，或1xTBST配制）封閉一晚上 或室溫1~2小時(shí)

當(dāng)一抗為抗磷酸化抗體時(shí)，脫脂奶粉由于含有較多磷酸化蛋白，請(qǐng)改為使用BSA。

2，一抗、二抗孵育

原理： 一抗可以與要檢測的蛋白特異結(jié)合，二抗可與一抗結(jié)合，同時(shí)二抗上帶有特異的酶（如辣根過氧化物酶HRP，堿性磷酸酶法AP等 ),標(biāo)記酶可以分解化學(xué)顯色底物產(chǎn)生有顏色的條帶或催化化學(xué)發(fā)光底物使膠片感光。

實(shí)驗(yàn)步驟：

一抗孵育：5%脫脂奶粉稀釋一抗到合適的濃度，與膜室溫孵育1小時(shí)或4度一晚上（抗體濃度及孵育時(shí)間需根據(jù)不同的抗體做相應(yīng)調(diào)整， 1xTBST，洗膜3次，每次5分鐘。

二抗孵育：5%脫脂奶粉稀釋二抗到合適的濃度，與膜室溫孵育1小時(shí)， 1x TBST,洗膜3次，每次5分鐘。